第六章　结直肠癌的分子病理学

分子病理学，是病理学的一个分支学科，主要通过检测器官、组织或体液中的生物大分子来研究疾病发生机制的一门交叉学科，融汇解剖病理学、临床病理学、分子生物学、生物化学、免疫化学、蛋白质组学、基因组学等学科，用分子生物学、生物化学和遗传学等方法对人类疾病进行诊断和分类，或明确疾病的预后、预测疾病对治疗的反应甚至筛选药物敏感基因等，为个体化医疗的诊断和治疗提供依据 ^[1]。而最近哈佛医学院病理系的Ogino撰文 ^[2]阐释的一门新兴交叉学科—分子病理流行病学（molecular pathological epidemiology），又拓展了分子病理学的研究范围。

结直肠癌分子病理学主要是研究结直肠癌发生的分子机制及对结直肠癌诊断、预后判断、遗传学筛查、预后分析或指导个体化治疗的药物敏感基因的筛选等几个方面。

IHC是临床分子病理检测中最早使用的一种简便、快捷而价廉的方法，对设备、人员的要求均不太高，目前在县市级以上的各级医院中广泛开展。即使在生物医学技术高度发达的今天，IHC仍占据重要的地位。参考相关文献 ^[3-5]和2015年NCCN指南（http：//www.nccn.org/index.asp），湖北省肿瘤医院病理科对结直肠癌手术切除标本常规行IHC检测错配修复（mismatch repair，MMR）的4个基因（MLH1，PMS2，MSH2和MSH6）、BRAF（V600E）突变基因（克隆号VE1）和标志癌细胞增殖指数的Ki-67这6个指标。在行错配修复4个基因IHC检测时，病理科医师应选择带正常黏膜（做内对照）的癌组织蜡块，判读IHC检测结果时，内对照的正常黏膜和肿瘤间质细胞核阳性而癌组织中所有细胞核阴性时，才能判读为MMR中某个基因缺失（即全或无），提示该患者可能为高频微卫星不稳定（High frequency microsatallite instability，MSI-H），这时建议行PCR检测Bethesda标准的5个微卫星位点。此外，由于突变基因表达的特定蛋白与遗传物质的改变之间并非一一对应的关系，这就决定了IHC检测有一定的局限性。例如抗EGFR抗体的IHC检测结果并不能反映EGFR基因的扩增或突变状态，此时应选择原位杂交或基因测序检测分别判断其扩增或突变状态 ^[6]。

原位杂交主要包括荧光原位杂交（fluorescent In situ hybridization，FISH）和显色原位杂交（chrom ogenic in situ hybridization，CISH）两种，是检测目的基因有无扩增的一种常用技术，临床主要用于检测HER-2和EGFR基因扩增状态。

包括直接测序法（如早期的sanger测序法）、焦磷酸测序法（pyrosequencing）、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析法、单链构象多态性分析法（single-strand conformation polymorphism analysis，SSCP）、扩增阻碍突变系统法PCR（amplification-refractory mutation system-PCR，ARMS-PCR）法、高分辨率熔解曲线法（high resolution melting curve analysis，HRM）。其中直接测序法和焦磷酸测序法可以检测到所有的基因突变，可作为基因测序的标准，但其具有耗时、昂贵、对标本要求较高且敏感度较低等缺点；其他几种方法都是针对特定的突变位点进行检测，并不能了解所有的突变位点。目前我国三甲医院病理科分子病理检测基因突变多采用ARMS-PCR法或直接测序法。基因芯片或称DNA微阵列（DNA microarray）技术以及刚兴起的二代测序法（next generation sequencing）均属高通量的基因检测 ^[7]。DNA样本可从人体新鲜组织、或石蜡包埋组织以及血液、体液中提取，并通过PCR扩增技术以提供足够量的DNA样品。而基因芯片和二代测序法大大提高检测效率并降低每例标本的成本，适合致病基因或药物敏感基因的筛查。

检测基因上游的启动子甲基化和微卫星不稳定性，可用PCR法、基因测序法等。PCR并毛细管电泳检测Bethesda标准的5个微卫星位点（BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250），如果至少有2个位点（≥40%）不一致，即为MSI-H；这种PCR法与上述的免疫组化法检测MMR蛋白这两种方法是目前最有效的筛查微卫星不稳定性的手段，而且两者之间的一致性高达90%以上 ^[8]。

遗传性结直肠癌是由胚系基因或某基因上游的启动子发生胚系改变引起的、在多种遗传性综合征基础上发生的CRC。主要包括如下几类 ^[9]：

1. 遗传性腺瘤性结直肠癌综合征（hereditary adenomatous colorectal cancer syndromes）即在家族性腺瘤息肉病（familial adenomatous polyposis，FAP）基础上发生的CRC；FAP是一种常染色体显性遗传病，由结肠腺瘤息肉（adenomatous polyposis coli，APC）基因发生胚系突变（germline mutation）引起；APC这个抑癌基因位于人类染色体的5q21-22，其突变不仅与FAP发生相关，而且与大部分散发性CRC及其他恶性肿瘤的发生也有关系。CRC发生的二次打击学说（Knudson two genetic hits）显示APC基因突变是大肠癌的腺瘤-腺癌发生序列上早于TP53和KRAS基因突变的早期分子事件。APC抑癌基因发生缺失或突变可以影响细胞的黏附、信号转导和活化等重要生物功能，激活其下游的Wnt信号通路，导致β钙环蛋白（β-catenin）不能降解而在胞浆内积聚并转移到胞核内，进一步激活MYC和CyclinD1基因转录，从而导致细胞发生恶性转化。

FAP临床特征是结直肠布满了大量的（100个以上，甚至数千个）腺瘤性息肉，见图6-1A。在儿童或青少年时代（10～15岁）就可发生肠道多发性息肉。早期的息肉仅在显微镜下可见，表现为单隐窝异常增生，随后进展为内镜下可见的多发性息肉病。如果病变肠管不切除，必然进展为腺癌（大多发生在50岁之前），见图6-1B。因此临床对FAP的筛查、诊断显得尤为重要。FAP的诊断标准 ^[9]：①100个或以上的结直肠腺瘤；②APC基因胚系突变；③有FAP家族史或年轻患者发现任何数量的腺瘤。但诊断衰减型FAP的标准并不限于此。此外，由于APC基因的胚系突变可以影响3个胚层的发育，因此我们还要注意FAP患者可能出现的肠外体征，如硬纤维瘤病、内生性或外生性骨疣、头面部多发性表皮样囊肿等症状。

2. Lynch 综合征（Lynch syndrome）Lynch 综合征是遗传性非息肉性结直肠癌（hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC）中最常见的一种，是由DNA错配修复基因（mismatch repair genes，MMR）缺陷造成的一种常染色体显性遗传病。人类DNA错配修复基因有6种：MLH1，PMS2，MSH2，MSH6，PMS1和MSH3；当这些MMR基因发生胚系缺陷、或MHL1基因启动子发生胚系甲基化而致MHL1基因失活、或TACSTD1基因外显子的3'端发生胚系缺失导致其下游的MSH2基因失活，总之使错配修复蛋白功能障碍，导致DNA复制过程中发生错误累积而致微卫星不稳定。Lynch 综合征在发生结直肠癌前后还可以发生肠外肿瘤，如子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌、输尿管癌、皮脂腺囊肿、角化棘皮瘤等。

分子病理对MSI及Lynch 综合征筛查诊断策略详见第十七章第一节。

3. MUTYH相关息肉病基础上发生的CRC MUTYH是一种碱基切除修复基因，该基因发生双等位突变会导致MUTYH相关息肉病（MUTYH-associated polyposis，MAP），这是一种常染色体隐性遗传病。MUTYH基因突变导致DNA氧化损伤不易修复，从而使G：C 突变为T：A，常累及APC、K-ras、TP53和SMAD4等基因，进而形成多发性肠道腺瘤。迄今为止，组织学特征不能区分散发性CRC、FAP和MAP基础上发生的CRC。但结直肠同时发生10个以上腺瘤而没有APC基因胚系突变、遗传家系调查显示常染色体隐性遗传病，即可诊断为可疑MAP，其确诊需要检测到MUTYH基因突变。MAP主要与FAP和Lynch综合征鉴别，临床监测与衰减型或非典型性FAP相同，详见第十七章第一节。

4. 幼年性息肉病基础上发生的CRC 幼年性息肉病（Juvenile polyposis，JP），又称错构瘤性胃肠道息肉病，是一种常染色体显性遗传病，特点为胃肠道多发幼年性息肉，2/3病例在20岁之前发病，是由SMAD4或BMPRIA基因发生胚系突变所致。这种多发性息肉有恶变潜能，患者一生累积癌变率为39%。JP诊断标准如下：①结直肠发现3～5个幼年性息肉；②胃肠道全长均存在幼年性息肉；③有幼年性息肉病家族史，发现任何数量的幼年性息肉。JP临床表现为胃肠道3～200个幼年性息肉，息肉一般有蒂，体积较大呈分叶状；组织学上间质水肿伴炎性细胞浸润，上皮间质比例升高，腺体囊性扩张。

5. Peutz-Jeghers综合征基础上发生的CRC Peutz-Jeghers综合征（Peutz-Jeghers Syndrome，PJS）是一种常染色体显性遗传病，由LKB1/STK11基因发生胚系突变所致；其临床特征为皮肤黏膜色素沉着（特别是唇周、肛周、手指、舌等处）和胃肠道（特别是小肠）多发性错构瘤性息肉。内镜下显示这种息肉粗大、表面粗糙，易发生肠套叠（可能为主要致死原因）；显微镜下可见特征性的树枝状平滑肌轴心，其上被覆的腺上皮可能异位到平滑肌的下方甚至浆膜下（占10%病例），形成极具欺骗性的假浸润，临床病理易误诊为高分化腺癌。与一般人群相比，PJS患者除了胃肠道息肉癌变高发外，其他恶性肿瘤，如子宫颈恶性腺瘤、卵巢环状小管性索肿瘤、睾丸支持细胞肿瘤、胰腺癌、乳腺癌等的发病风险也明显升高。

6. 其他少见遗传综合征相关结直肠癌 ^[9]其他少见遗传综合征包括：并非MMR基因胚系缺陷所致的家族性结直肠癌X型、PTEN基因突变导致的Cowden 综合征、TP53突变导致的Li-Fraumeni综合征等均显示胚系基因突变，且易发生CRC。

无论遗传性还是非遗传性CRC，本质上都是各种原因导致的基因或表观基因发生改变所致，两者的区别在于上述遗传物质的改变是否为胚系突变所致。因此，前述的MSI、MUTYH、APC、KRAS、BRAF、TP53和SMAD4基因突变等遗传学改变在散发性CRC中亦可发生。

这里只简单介绍目前国内外临床病理界及NCCN指南推荐的具有个体化诊疗价值的KRAS、NRAS、BRAF、MMR基因及MSI检测 ^[10-11]。

KRAS基因是一种重要的原癌基因，位于人类12号染色体，编码产物为KRAS蛋白，位于细胞质内EGFR信号通路的下游。早在2006年就有人发现抗EGFR靶向药物的疗效与KRAS基因突变有关 ^[12]，后续研究 ^[10]进一步证实KRAS基因野生型结直肠癌患者接受抗EGFR靶向治疗有效而突变型无效。因此2009版NCCN指南就开始规定所有转移性CRC患者都应检测KRAS基因状态，只有KRAS基因野生型的患者接受抗EGFR靶向治疗才有效。但随后越来越多的证据 ^[11，13-14]表明，仅仅检测KRAS基因状态还不够，NRAS基因突变时抗EGFR靶向治疗也无效。因此2014版NCCN指南推荐mCRC患者在接受EGFR靶向治疗之前需常规检测KRAS和NRAS的2号、3号和4号外显子的相关位点，只有KRAS和NRAS均无突变的患者才能从抗EGFR靶向治疗中获益。目前多采用焦磷酸测序法（pyrosequencing）检测KRAS和NRAS基因突变。

BRAF基因也是一种原癌基因，位于人类染色体7q34，由18个外显子和17个内含子组成，编码 B. Raf蛋白，在MEK/ERK信号通路及细胞生长过程中发挥重要作用。超过＞90%的突变发生在碱基序列的第1799位，由腺苷酸取代了胸腺嘧啶，最终使B. Raf蛋白第600位的缬氨酸（V）被谷氨酸替代（E），称作BRAF（V600E）突变。目前针对这种突变蛋白的特异性抗体已商品化，用此抗体做IHC检测BRAF（V600E）突变与基因测序之间的一致性高达90%，目前已在我国大型三甲医院病理科广泛应用 ^[15-17]。文献报道大约15%的散发性CRC患者发生BRAF基因突变 ^[9]。一般来说，发生BRAF基因突变的患者预后不良，此类患者对抗EGFR靶向药物西妥昔单抗的疗效欠佳，而对新开发的靶向BRAF（V600E）抑制剂菲罗替尼（Vemurafenib）可能有效 ^[18]。

微卫星又称作短串连重复序列（short tandem repeats，STR）或简单重复序列（simple sequence repeat，SSR），是由2～6个核苷酸组成，常见的有2、3、4核苷酸重复序列，尤以二核苷酸的重复序列（CA/GT）n最常见；重复次数一般15～60次，重复单位结构相同，其长度一般小于200bp。

错配修复基因存在缺陷不能表达时会出现DNA复制错误积累，导致MSI发生。MMR基因缺陷与MSI之间存在很好的一致性，因此检测MMR基因或蛋白的表达情况可以反映MSI状态 ^[19]。目前研究最多的人类MMR基因有6种，分别为hMSH2、hMSH3、hMSH6、hMLH1、hPMS1和hPMS2，其中常见的突变基因为hMSH2、hMSH6、hLMH1和hPMS2等4种，因此临床推荐常规检测后4种基因。基因测序分析可明确这些基因的突变情况，但费时费力且成本很高，难以在临床推广应用。目前推荐使用免疫组化和PCR检测进行初筛 ^[8-9，20]。一般策略是先针对手术切除的CRC石蜡切片行常见的4种MMR蛋白IHC检测，如果其中任一基因完全缺失，再采用PCR法检测Bethesda推荐的5个微卫星位点（BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250）以进一步确诊，两者之间有很好一致性及可信度 ^[8]。

IHC检测MMR蛋白的结果判读 ^[20]：以肿瘤细胞旁正常的肠黏膜上皮和浸润的淋巴细胞、纤维间质细胞作为内对照，比较肿瘤细胞核与非肿瘤性细胞核MMR蛋白表达的差异；当全部的肿瘤细胞核蓝染（阴性反应），而肿瘤细胞旁的正常肠黏膜上皮或间质细胞（包括浸润的淋巴细胞、肌纤维/纤维母细胞等）核着染成棕色（阳性反应）时，即显示癌细胞全部为MMR蛋白缺失（如图6-2A、B），结果判读为MMR缺失（deficient mismatch repair，dMMR）。反之，当1个及以上的肿瘤细胞核染色为棕色（阳性反应）时（如图6-2C、D），则判读为MMR无缺失（proficient MMR，pMMR）。

研究发现，合并MSI-H的Ⅱ期、Ⅲ期CRC患者预后较好 ^[21-22]。临床研究显示Ⅱ期和Ⅲ期CRC合并MSI-H的患者单用5-FU治疗并不获益，相反，对伊立替康和奥沙利铂治疗有效。因此，建议CRC患者化疗前行MSI测定，以指导化疗方案选择。综上所述，MSI检测具有重要的临床意义，可以指导CRC患者个体化医疗，在预后评估和化疗药物选择方面具有价值。

国内外研究表明，伴发MSI-H的CRC临床病理学特征 ^[23-24]包括：右半结肠多发、原发肿瘤大、分化低（实片状、梁状、髓样癌或黏液腺癌）、癌组织淋巴细胞浸润明显、血清CEA水平高等。但我国有69.2%的MSI-H 肿瘤位于直肠，可能与我国直肠癌发病率较高有关。一般来说，伴发MSI-H的CRC发病年龄较轻（特别是Lynch综合征患者）、但淋巴结转移发生率低及局部浸润较少见，形态学上虽属低分化癌，但预后相对较好。一般dMMR/MSI-H的CRC癌组织中均有明显的淋巴细胞浸润，这一形态特征为免疫治疗提供了形态学依据；最近研究结果 ^[25]也证实PD-1抑制剂pembrolizumab能显著延长伴发dMMR的晚期CRC患者的无进展生存期。

几乎所有的Lynch综合征表现为MSI-H，如前所述，这是由MMR基因或其启动子发生胚系突变所致。此外，大约15%的散发性CRC体细胞hMLH1基因启动子甲基化而导致MLH1基因不表达而表现为MSI-H，此时IHC检测癌细胞均不表达MLH1蛋白。因此，IHC结果判定为MLH1缺失时需进一步行hMLH1启动子甲基化检测，以判断患者为Lynch综合征导致的CRC还是散发性CRC。最近研究表明，BRAF基因突变检测结果协同MMR检测可帮助判断CRC起源，即MLH1缺失而BRAF基因突变者可以排除Lynch综合征，这是因为BRAF基因突变与MMR基因胚系突变是相互排斥的，二者不可能同时发生于同一患者 ^[26]。

目前WHO对散发性CRC的分类主要是基于形态学改变，但这种传统分类对个体化医疗的指导作用有限，比如同一TMN分期的不同患者，其生存情况以及对化疗和靶向药物（如西妥昔单抗）治疗的反应不同，因此学者们积极探索基于肿瘤组织形态、分子表型和对治疗反应的全新分类系统。二十多年前，Fearon 和Vogelstein 即从结直肠癌发生过程中ras基因、第5、17、18号染色体改变的角度阐述了其可能的分子表型的差异 ^[27-28]。后来的研究显示CRC的发生本质上是由于染色体不稳定（CIN） ^[29]、微卫星不稳定（MSI） ^[30]或基因启动子的CpG岛甲基化（CIMP） ^[31]这3种分子事件导致的。2007年Jass ^[32]结合CRC临床特征、形态学及分子改变，明确将所有结直肠癌分成5类：①CIMP-H/MSI-H/BRAF 突变型；②CIMP-H/MSI-L或MSS/BRAF 突变型；③CIMP-L/MSS 或 MSI-L/KRAS 突变型；④CIMP-N/MSS；⑤Lynch 综合征（CIMP-N/MSI-H）。2013年初人类癌症基因蓝图（The Cancer Genome Atlas，TCGA）研究组发布的报告揭示散发性CRC患者在基因（包括APC、TP53、SMAD4、PIK3CA、KRAS、MYC、WNT和TGF-β等）、启动子甲基化、MSI及CIN等多个层次的遗传学改变，揭示对结直肠癌分子分型的遗传学基础 ^[33]。随后Sadanandam等根据分子遗传学、病理形态学、对西妥昔单抗（cetuximab）治疗的反应等条件，将CRC分成5型 ^[34]：①杯状细胞样型（goblet-like），②肠上皮细胞型（enterocyte），③干细胞样型（stem-like），④炎症型（inflammatory），⑤转移-扩增型（transit-amplifying，TA）。TA型根据对西妥昔单抗治疗的反应分成敏感型（CS-TA）和抵抗型（CR-TA）2型。同年，Budinska ^[35]也通过高通量基因检测技术，综合分析基因表达谱、临床特征、预后、肿瘤形态特征、已知常用的分子标志物等方面，将CRC分为5型：表面隐窝样（A型）、底部隐窝样（B型）、高CIMP 样（C型）、间质型（D型）、混合型（E型）。病理形态上A型以锯齿状为主，其次是乳头状；B型和E型以复杂小管状结构为主；C型以实片状结构为主，其次是黏液腺癌；D型以明显的间质反应为其显著特征。

关于CRC分子病理的研究很多，近年来发现microRNA、lncRNA等非编码遗传物质的改变也可导致CRC的发生 ^[36-37]。分子病理学的发展将促进CRC的分子分型在临床的开展，但也提示CRC分子分型还在不断地更新、完善中。我们相信，随着国内外精准医学的发展，我们对CRC发生发展机制的了解会更清楚，我们期望尽快产生一种检测便捷、临床实用、可操作性强的分子分类标准，以便更好地指导临床诊断、精准治疗、监测随访以及预后判断。